Establishing the generic type of calcius.

Необходимость решения вопроса о принадлежности костей человеку или животному обычно возникает при экспертизе сожженных и зольных останков. Эксперты в этом случае сталкиваются с необходимостью исследовать множество мелких и крупных костных фрагментов, находящихся в различной стадии температурного каления (черное, серое, белое), подвергшихся усадке, деформации и многообразному воздействию факторов внешней среды. Поэтому каждая подобная экспертиза уникальна по количеству и составу объектов, по числу использованных лабораторных методов и набору диагностических методик.

Мы сочли возможным обратить внимание экспертов медико-криминалистического профиля лишь на общие методические принципы проведения таких экспертиз: рациональный выбор методов, доказательность и пределы возможности методов, ограничительные условия выполнения исследований, формы выводов.

Судебно-медицинское определение видовой принадлежности костных фрагментов, строго говоря, возможно только на основе биологических методов исследования. Во всех других случаях правильнее будет говорить об определении происхождения костей (нативных, озоленных) человеку, животному или птице.

Исследование наличия костного вещества

Прежде чем определять видовую принадлежность, необходимо убедиться в том, что представленные объекты являются костной тканью.

Костные и зубные фрагменты визуально опознаются уже при массе около 1 г и размерах 6х3х2мм ^[1]. Но при большом их числе необходимо отбраковать рентгенопрозрачные (частицы древесного угля, пластика и др.) и рентгеноконтрастные (мелкие камешки, частицы земли и металла) включения.

При пылевидной золе костное вещество идентифицируют с помощью атомной (рентгено-флуоресцентный, эмиссионный спектральный анализ, РФА, ЭСА) и молекулярной (инфракрасная спектрофотометрия, ИКС) спектроскопии. Наличие большого количества фосфора, который является макроэлементом костной ткани, позволяет решать эту задачу практически безошибочно. Значительные трудности возникают, когда на исследование поступает смесь зол, поскольку нельзя установить, в каких соотношениях произошло смешение золы сожженного трупа с золой топлива. В подобной ситуации необходимо использовать ИКС. Допустимый предел выявления костного вещества к топливной золе соответственно 1:7.

ИК-спектры костей и твердых тканей зуба уникальны (рис.1) В них наблюдаются интенсивные полосы поглощения, связанные с колебанием иона РО^3-₄ (ортофосфаты): 900-1150 см^-1 (валентные колебания) и 500-650 см^-1 (деформационные колебания); аниона СО^2-₃ (880,1430 и 1460 см^-1),а также полосы поглощения, относящиеся к колебаниям: белкового компонента – амиды I, II, III (1660, 1540, 1240см^-1), липидов (1740 см^-1) и метильных групп (2870, 2940 см^-1).

Спектры костного вещества позволяют установить, подвергались ли представленные объекты сожжению, а также длительность и температуру кремации.

ИК-спектры нативной и сожженной костной и зубной тканей по неорганической основе идентичны и резко отличаются от зольных останков топлива и инородных частиц.

Наличие белкового компонента в ИК-спектрах костного фрагмента указывает не только на целесообразность иммунобиологической диагностики видовой принадлежности, но и на возможность молекулярно-генетической идентификации личности в том случае, если костные фрагменты принадлежали человеку. Отсутствие белка в костной ткани (температура сожжения свыше 400°С) исключает использование указанных методов.

Иммунобиологическое исследование

Применяется после того как установлено, что представленный объект является костью и содержит белковые фракции. И лишь затем используют реакцию преципитации Чистовича-Уленгута. Сожженные костные останки в стадии серого и белого каления данному исследованию не подлежат.

Для проведения реакции преципитации требуется преципитирующая сыворотка, содержащая антитела (преципитины) на определенный вид белка, и вытяжка из исследуемого образца кости, содержащая искомый белок.

Перед исследованием проверяют титр и специфичность всех преципитирующих сывороток, которые будут использованы в реакции. Их выбор помимо сыворотки на белок человека (которая является основной) производят в зависимости от конкретных обстоятельств случая.

Вытяжку из измельченной в порошок костной ткани (вибромельница, 5-10 минут) готовят путем экстрагирования стерильным физиологическим раствором (0,85%) при температуре от +4 до +10°С в течение одних и более (3-4) суток.

При наличии помутнения или осадка вытяжку фильтруют или центрифугируют. Затем с помощью пробы с азотной кислотой в капилляре концентрацию белка доводят физраствором до разведения 1:1000.

При соединении преципитирующей сыворотки и вытяжки происходит взаимодействие одноименных антител и антигена и на границе соприкосновения выпадает осадок белка (преципитат) в виде серовато-голубоватого диска. Срок наблюдения реакции 1 час.

В случаях исследования костей большой давности или испытавших воздействие высокой температуры, радиации, мацерации в воде и других жидкостях, возможны ошибочные экспертные выводы, в частности отрицательные результаты реакции преципитации или выпадение неспецифических осадков.

Поэтому при исследовании костей, подвергшихся термическому воздействию, но по данным ИКС сохранивших белковые фракции, реакцию следует производить со всеми преципитирующими сыворотками, изготовляющимися в настоящее время на различные виды белка ^[2].

При отрицательном результате реакции с сывороткой, преципитирующей белок человека, принимают все меры к установлению, какому именно животному (птице) принадлежит исследуемая кость.

Сравнительно-анатомическое исследование

Сравнительная морфология скелета человека и животных в судебно-медицинской литературе представлена недостаточно ^[3]. Атлас В.И. Пашковой по дифференциальной диагностике основных костей скелета 10 видов животных и человека не опубликован и фактически не известен экспертам-практикам. Соответствующие источники по видам животных имеют ветеринарную направленность и не касаются скелета человека ^[4]. Исключением является работа ^[5], в которой рассмотрены качественные различия поясничных позвонков человека и некоторых животных (лошадь, корова, свинья, овца, собака, кошка, бурый медведь, олень).

Сравнительно-анатомическая диагностика основана на исследовании анатомических особенностей костей, их габаритных размеров и толщины коркового слоя. При наличии целых костей или крупных фрагментов (с более или менее характерными анатомическими образованиями) дифференциация их принадлежности человеку или животному осуществляется при беглом осмотре. И лишь иногда в качестве эталона используют кости скелета человека, реже - животных. При бесспорном отличии представленного объекта от конкретной кости человека дальнейшее исследование вида животного (птицы) обычно не производится.

Сравнительно-анатомический метод следует использовать весьма осмотрительно, поскольку имеется сходство многих костей человека с костями животного, особенно если это касается фрагментов с явлениями термической трансформации. Необходимо помнить, что метод результативен лишь в случаях, когда анатомическая локализация (конкретная кость туловища, головы, верхней и нижней конечностей, зубы), право- или левосторонняя принадлежность и уровень отчленения костного (зубного) отломка сомнений не вызывает. При малейшей неясности следует обращаться к другим методам исследования (см. ниже), либо к специалисту–зоологу. Особое внимание необходимо уделять также реконструкции костей по их отдельным фрагментам (идентификация целого по частям), что ведет к улучшению диагностических перспектив и минимизации объектов, подлежащих дальнейшему лабораторному исследованию.

Остеометрическое исследование

Работы в этом направлении единичны и почти не известны практическим экспертам. Д.Д. Джамолов ^[6], проанализировав размерные характеристики поясничных позвонков человека, мелкого рогатого скота, бурого медведя и собаки, разработал классификационную таблицу их различий, которую рекомендовал для экспертного исследования. К сожалению, методика, не рассчитанная на фрагментированные позвонки, широкого применения не получила.

В.И. Добряк провел измерение толщины и площади поперечного сечения компакты стенок трубчатых костей у ряда домашних животных (кролик, кошка, собака, свинья, лошадь и др.), некоторых птиц (курица, утка, гусь, индюк) и человека. Площадь компакты оказалась пригодной лишь для дифференциации костей зрелых домашних птиц, кролика и кошки от костей новорожденного и ребенка 2-3 месяцев жизни. Среднее процентное отношение площади компактного вещества к периметру кости для человека составляет 81-88%, для птиц и кролика - 44-48%, для кошки – 65%. Общие поперечные размеры диафизов костей на границе с метафизами, превышающие 41 мм, а на уровне средней трети – более 33 мм, не характерны для костей человека, в том числе и для таких крупных, как бедренная и большая берцовая ^[7], находящихся в нативном и тем более в сожженном состоянии.

Результаты, по мнению автора, могут использоваться при определении видовой принадлежности (домашние животные, птицы), но, как видим, только применительно к трубчатым костям.

К остеометрии следует прибегать при незначительной фрагментации костей или при сохранности наиболее характерных анатомических сегментов. Она может оказаться полезной при исследовании костных отломков, условно отнесенных к группе принадлежащих человеку.

Определенный интерес для сравнительного исследования в этом случае может представлять сводка данных по человеческому скелету (нативные и сожженные фрагменты 15 костей, измеренные по 53 признакам) ^[8].

Микроскопическое исследование

Наиболее обширные исследования по сравнительной микроскопии костной ткани на гистопрепаратах и шлифах выполнены на кафедре судебной медицины Воронежского медицинского института под руководством профессора Ю.М. Гладышева ^{[9, 10, 11]}.

Выявлено, что для костей человека типичны: многократная перестройка большинства вторичных остеонов, наличие дочерних конструкций четвертой и пятой генераций (рис. 2), полная перестройка грубоволокнистой ткани на пластинчатую, пестрота теней вторичных остеонов на рентгенограммах шлифов, обусловленная слабой, средней и сильной степенью минерализации.

Для костей животных характерны: сетевидные остеоны, занимающие обширные участки шлифов, остеоны-соустья у периостального и эндостального краев, множественные первичные цилиндрические остеоны, встречающиеся во всех зонах, перестройка единичных вторичных остеонов, наличие вставок грубоволокнистой костной ткани в средней и эндостальной зонах шлифа, параллельные ряды вторичных остеонов (рис. 3), развитие «мозговой» кости у несущихся птиц, равномерная сильная минерализация большинства остеонов на микрорентгенограммах. Эти особенности длинных трубчатых костей характерны как для животных, так и для некоторых домашних птиц (куры, гуси).

Исследование видовой микроструктуры костной ткани, как выяснилось, можно проводить не только на шлифах (толщина от 60 до 100 мкм), но и на блоках ^[12]. Данный способ более удобен при экспертизе хрупких фрагментов сожженных костей.

Микрометрическое исследование

Возможность определения видовой принадлежности костей указанным методом на поперечных шлифах установлена в начале XX века, сводка данных изложена П.С. Семеновским ^[13]. При этом оказалось, что число гаверсовых каналов в костях животного (в поле зрения) в среднем в 2-3 и даже 7 раз больше, чем в соответствующих костях человека, а их диаметр соответственно меньше. Так, на поперечном шлифе трубчатых костей у человека можно насчитать 6-10 гаверсовых каналов, реже 20, а в соответствующих костях животного значительно больше: собака, свинья – до 50, овца – до 60, корова- до 70 (окуляр - 4, объектив – 3), разница еще заметней у птиц.

У взрослого человека средние размеры широтного диаметра гаверсова канала практически не зависят от сегмента скелета, и колеблется от 43 до 46 мкм, у новорожденного – от 27 до 32 мкм. У животных соответствующие размеры равны: 11-14 мкм (кошка, кролик, заяц), собака – 16-18 мкм, свинья – 20-22 мкм, корова, лошадь - 24-27 мкм. У домашних и диких птиц (курица, гусь, утка, индюк, глухарь и др.) признак варьирует от 7 до 12 мкм ^[13]. Гаверсовые каналы остеонов с явлениями резорбции исследованию не подлежат.

Хотя более поздние проверочные исследования подтвердили выявленные закономерности ^[14,15], математически корректная методика дифференциальной диагностики костей человека и животных по указанным признакам отсутствует.

В настоящее время эксперты чаще всего используют методику Л.Л. Голубовича ^[16], касающуюся полостей (лакун) костных клеток. Исследование длины и ширины лакун, их числа на площади 10000 мкм² проводится с помощью окуляр-микрометра. Если костные лакуны выходят за край квадрата, то учитываются лишь те, которые пересекаются двумя взаимно перпендикулярными линиями - например, верхней и левой, а лакуны, пересекающиеся нижней и правой линиями, в расчет не берутся. В препаратах из каждой кости определяется длина и ширина 100 лакун и производится подсчет их числа на 100 участках. Результаты усредняются. Для человека достоверно характерны длина костных лакун более 30 мкм, их ширина 6,2 мкм и их число менее 8,0, для животных - соответственно менее 18 мкм, менее 2,9 мкм и более 13,0. По данным одномерного дискриминантного анализа, вероятность установления происхождения костной золы от человека составляет 58-79%, от животного – 78-86%. Методика успешно используется при исследовании мельчайших костных частиц и костной золы в стадии серого каления. При черном калении частицы на спиртовке дожигаются до серого. На исследование птиц методика не рассчитана.

Имеется модификация методики, позволившая повысить точность диагностики путем учета частоты совместного распределения параметров костных лакун ^[17].

Атомно-эмиссионный спектральный анализ

Объекты исследования – костные фрагменты любой величины, но не менее 2-3 мм² и массой не менее 30 мг. Озоление (до постоянного веса) обязательно для нативных костей, а также костных фрагментов из кострищ и отопительных очагов в стадии черного каления.

Метод используется применительно к группам объектов, непригодным для сравнительно-анатомического исследования: 1) фрагменты трубчатых, плоских, губчатых костей, лишенные анатомических ориентиров для определения принадлежности к определенной кости или ее уровню; 2) мелкие костные фрагменты, полностью утратившие анатомические ориентиры и признаки типа кости (трубчатая, плоская, губчатая); 3) мельчайшие костные частицы в зольных останках.

Ограничительные особенности: большая давность захоронения объектов, загрязнение продуктами нефтехимии, стадия белого каления с деструкцией минерального компонента.

Спектры снимают на спектрографе ИСП-30. Для измерения интенсивности спектральных линий в настоящее время используются многоканальные анализаторы атомно-эмиссионных спектров типа МИРС или МАЭС, отвечающие современным требованиям по автоматизации измерений, предъявляемым к спектральному оборудованию.

Экспертный интерес к видовой диагностике костей методом ЭСА возник в связи с обнаружением качественных различий костной ткани человека и некоторых животных по барию ^[18].

В дальнейшем эта особенность получила свое подтверждение ^[19] только к костям всех видов крупного и мелкого рогатого скота (корова, лось, баран и т.д.), что обусловило необходимость изучения всего комплекса макро- и микроэлементного состава костной ткани.

Проверочные исследования показали, что наличие бария достоверно дифференцирует ребро барана от ребер человека и свиньи. Вместе с тем, присутствие большого количества калия в ребрах отличает свинью от человека и барана. В ребрах человека, свиньи и барана имеются сдвиги по содержанию меди, стронция, алюминия и свинца ^[20].

Качественная и полуколичественная оценка проведена для вываренной костной ткани бедра человека и некоторых видов животных (корова, свинья). Корова отличалась по наличию бария и содержанию алюминия, свинца, магния, кремния; свинья – по стронцию, калию, натрию и цинку ^[21].

Исследование тазовых и лопаточных костей человека по отношению к некоторым животным (корова, свинья, собака) выявило различие в содержании магния, натрия, цинка и меди. Критерием видовой дифференциации по тазовым костям являлись коэффициенты соотношений:Zn/Na, Zn/Fe, Zn/Na, Na/Mg, по лопаточным костям – Fe/Mg ^[22].

При исследовании микроэлементов костной ткани ребер детей и взрослых, собак и кроликов выявлено, что ребра детей отличаются от ребер собак по содержанию бария и свинца, меди и серебра и от ребер кроликов содержанием бария, ванадия и марганца. При этом для ребер собак и кроликов предпочтительны коэффициенты соотношений – Mn/Pb, Mn/Cr, Mn/Ba, Mn/V, Mn/Ni ^[23].

Наличие в костной ткани бария, свинца, серебра и ванадия, по нашему мнению, является геохимической особенностью Закарпатья и, следовательно, проблема видовой принадлежности костей более сложна, чем это принято считать.

Анализ по макро- и микроэлементному составу бедренной кости и грудине человека, по отношению некоторых видов животных (олень северный, овца, собака, лисица, бурый медведь, кролик), также показал различия по уровню содержания бария, стронция, натрия, магния, кремния, цинка, марганца. При этом по барию у оленя и овцы имеется качественное отличие, а у человека – незначительные следовые количества ^[24].

При исследовании проб костной ткани человека, домашних и диких животных (корова, баран, свинья, лошадь, кролик, лось, зубр) обнаружено не только отличие от человека по барию, стронцию, магнию, марганцу, железу, меди, алюминию, цинку, но и возможность дифференциации домашних и диких видов животных ^[25].

Для экспертного применения создана диагностическая модель из уравнений канонического дискриминантного анализа для групп: “человек – кролик – олень”; “человек – корова – свинья”; “человек – свинья” ^[26]. В костном веществе объектов (грудина человека и указанных животных) исследованы барий, стронций, хром, натрий, цинк, медь, кальций, алюминий, железо, свинец, марганец, магний, фосфор, кремний. Для уменьшения возможности ошибок рекомендуется нормировка коэффициентов относительного содержания макро– и микроэлементов по ΔS.

В случае с группой “человек – кролик – олень” точность при классификации объектов 100%; в случае групп: “человек – корова – свинья” и “человек – свинья” – отдельные группы “человек” и “корова” клафиссицируются хуже, чем группы “человек” и “свинья”. Возможны ложноположительные результаты в группе “человек – корова – свинья” при установлении костей человека.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают принципиальную возможность установления видовой принадлежности костной ткани по макро- и микроэлементному составу. Поэтому для облегчения диагностики в каждой спектральной лаборатории рекомендуется иметь коллекцию костей различных видов животных (своего региона) для параллельного контрольного спектрографирования с экспертными образцами ^[27].

Установление видовой принадлежности костных останков является одной из самых сложных проблем судебной медицины. Это связано не только с многообразием и сложностью объектов экспертизы, но и с необходимостью решения широкого круга вопросов, требующих соответствующего лабораторного и методического обеспечения. Полнота и качество проводимых экспертиз такого рода имеет зачастую не только судебно-медицинское, но и важное гуманитарное значение. Сошлемся на случай из нашей практики.

В 2000 году в районе заброшенного Четырехбратского рудника Екатеринбургской области поисковой группой археологов обнаружены сожженные костные останки предположительно двух членов семьи Николая II. На экспертизу были представлены 64 объекта. При сравнительно-анатомическом исследовании установлено, что два из них являются частями большой берцовой кости коровы, а третий - VI поясничного позвонка овцы.

По данным рентгенографии и ИКС, 6 объектов оказались частицами древесного угля и земли. При микроскопическом и микрометрическом исследовании выяснено, что 37 объектов бесспорно относятся к костям животных. Но установить происхождение оставшихся 18 объектов не удалось, ввиду плохой сохранности костной структуры на поперечных шлифах.

При эмиссионном спектральном анализе во всех без исключения костных объектах (58) обнаружено резко повышенное содержания бария, которое указывало на бесспорную принадлежность животным (овца, баран, корова и др.) ^[28].

Таким образом, результаты проведенного исследования представленных 64 объектов исключили принадлежность сожженных останков членам семьи Николая II ^[1]. Захоронение цесаревича Алексея и Великой княгини Марии было найдено 7 лет спустя, в июле 2007 года. Результаты нашего исследования опубликованы ^[28]. Добавим только то, что среди их останков методами микрометрии и РФА обнаружены 3 фрагмента, являвшихся костями животного. Комментарии излишни.