The study of the most appropriate ways of extracting tannins from creeping thyme in the flora of Azerbaijan

Mamedova Rena Firudin kızı PhD in Biology Senior lecturer at the Department of Information Science of Azerbaijan Cooperation Technology AZ-1102, Azerbaidzhan, respublika Respublika, g. Baku, 9- mikr-N, ul. Mir Dzhalala, dom 52 kv. 49, kv. kvartira rena.mamedova2015@mail.ru

Babayev Medjnun Shykhbaba oglu Doctor of Biology Professor at the Department of Genetics of Baku State University AZ-1148, Azerbaidzhan, respublika Respublika, g. Baku, ul. Zakhida Khalilova, 23, kab. kabinet babayev_1940@mail.ru

Актуальность темы исследования

Изыскание эффективных лекарственных средств на основе природных соединений является одной из важнейших задач современной фармацевтической науки. При этом особое значение придается изучению дикорастущих лекарственных растений и использованию их как в виде лекарственного растительного сырья, так и для получения лекарственных препаратов. В связи с стремительным сокращением запасов лекарственного растительного сырья появляется необходимость расширения сырьевой базы этих растений за счет дополнительных растительных источников и комплексного их использования. С этой точки зрения несомненный интерес представляют растения рода тимьян (Thymus) семейства яснотковые (Lamiaceae).

До настоящего времени в азербайджане проводились исследования химического состава тимьяна ползучего по определению содержания экстрактивных веществ, в частности исследования химического и количественного состава эфирного масла (смеси химических соединений - терпенов и их производных и проч.). В этих исследованиях отсутствовали методы определения количественного состава действующих, в частности, дубильных веществ. В связи с этим, возникает актуальность исследования количественного состава содержания дубильных веществ у тимьяна ползучего.

Цель и задачи

Целью нашего исследования явилось изучение количественного состава дубильных веществ растений рода тимьян ползучий, широко распространенного во флоре азербайджана, и экспериментально-теоретическое обоснование зависимости процентного содержания дубильных веществ от методов экстракции.

Для достижения поставленной цели были обозначены следующие задачи:

1. Обобщить современные данные по распространенности и изучению химического состава тимьянов, произрастающих на территории азербайджана;

2. Провести исследование для количественного определения процентного содержания дубильных веществ в траве растений рода тимьян ползучий.

Введение

С глубокой древности в народной медицине тимьян (чабрец) находит широкое применение. Упоминание о нем встречается в сочинениях древнегреческих ученых - Гиппократа и Аристотеля, где он считался символом трудолюбия. Самым целебным в Элладе в античные времена считался мед, собранный пчелами на горе Химетос, полностью покрытый зарослями чабреца. ^{[9, с. 215-218]}.

Рисуник 3

Чабрец произрастает в основном на песчаных почвах в лесах Евразии, от Скандинавии до Средиземноморья и от Британии до Восточной Сибири. В природе можно встретить около 400 видов этого растения, а в разных регионах Азербайджана встречаются около 20 видов. Одним из широко распространенных видов этого растения является Тимьян ползучий – (Thymus serpyelum L), который представляет собой куст высотой примерно 2-10 см с приподнимающими или опушенными под соцветием цветоносными побегами, отходящими от деревянистых ползучих укореняющихся стволиков. Эти стволики всегда оканчиваются лежачим бесплодным побегом. Листья чабреца тонкие, мягкие с хорошо заметными жилками, линейные или эллиптические, длиной 5-10 мм и шириной 1,5-3 мм, с малозаметными точечными железками, с черешками, по краю до середины длиннореснитчатыми. Листья в верхней части у соцветия имеют эллиптические формы и угловатые края. Все цветки тимьяна собраны в головчатые соцветия. Цветоножки значительно короче чашечки, коротко волосистые. Чашечка узкоколокольчатая длиной 4-4,5 мм, густо опушенная. Три зубца верхней губы чашечки мелкие (средний более крупный), остротреугольные, отогнутые, реснитчатые по краям. Венчик в основном яркий, розово-фиолетовый, редко белый. Плод – ценобий. Орешки, гладкие, коротко эллипсоидальные, черно-бурые, длиной около 0,5 мм. ^{[10, с. 33-36]}.

Из обзора литературы следует, что количество эфирного масла в тимьяне ползучем в различных регионах мира находится в диапазоне от 0,46% до 4,45%. Основными компонентами эфирного масла чабрецов являются тимол и карвакрол. Содержание фенолов тимьяна ползучего составило: тимола 0,210-1,015%, карвакрола 0,085-1,405%, суммы фенолов 0,375-1,615%, причем в одних образцах преобладает тимол, в других карвакрол ^{[8, с. 69-71]}.

Действие препаратов, полученных из тимьяна, связано с присутствием в них летучих компонентов, обусловливающих специфический приятный запах самой травы и препаратов, приготовленных на ее основе. Масло тимьяна содержит 1-3% ароматических веществ, которые называются тимол, карвакрол, борнеол и терпинен. Также в чабреце можно найти флавоноиды, дубильные вещества, камеди, смолы, олеаноловую и урсоловую, кофейную, хинную кислоты, сапонины, горечи. В связи с вышеизложенным, растения рода тимьян имеют широкие лечебные свойства.

Обзор литературы гласит, что при исследовании эфирного масла тимьяна ползучего флоры Кавказа выявлено два хемотипа : 1 - тимол (76,1 – 81,5%), p-цимен, карвакрол, β-кариофиллен, α-терпинеол; и 2 - карвакрол (49,0 – 62,0%), тимол (21,5 – 29,7%), р-цимен, β-кариофиллен, α-терпинеол ^{[10, с. 27-29]}.

При исследовании химического состава эфирного масла тимьяна ползучего из разных районов азербайджана установлено, что его содержание варьировало от 0,26% до 2,34%. В качественном составе эфирного масла различных образцов наблюдались значительные различия. Суммарное содержание тимола и карвакрола в изученных образцах эфирного масла составляло не менее 78,7%. При этом, в процессе развития растений содержание эфирного масла в растениях значительно возрастало и достигало максимума в фазу цветения. Наблюдалась тенденция снижения количества тимола в масле в процессе развития растений ^{[11, с. 153-162]}.

Как уже отмечалось, лечебные свойства тимьяна известны с древности. В современной медицине тимьян широко используется при желудочно-кишечных заболеваниях, воспалении дыхательных путей, при зубной боли, в качестве противомикробного, дезинфицирующего и анальгетического средства ^{[4, с. 882-885]}. Кроме того, тимьян употребляется в виде отхаркивающей мекстуры от кашля, особенно коклюша, под названием пертусин. Эфирное масло используется для полоскания горла в виде слабо концентрированного спиртового раствора, а также в качестве дезинфицирующего средства для наружного применения при кожных заболеваниях. Тимьян используется как ароматизирующее средство при принятии ванны.

В эфирном масле тимьяна тимол обладает жгучим вкусом и сильным антисептическим эффектом. В медицине тимол используется для дезинфекции слизистых оболочек рта и горла, при грибковых заболеваниях кожи, в качестве средства против глистов и для подавления метеоризма в кишечнике. При бронхите, бронхоэктазии и пневмонии рекомендуется принимать по 1 столовой ложке 4-6 раз в день в качестве отхаркивающего и дезинфицирующего средства. Эти настои и отвары делают из 15-20 г тимьяна в 1 стакане воды. В народной медицине настой тимьяна принимают перед едой в период вздутия живота, что улучшает пищеварение и образуется в кишечнике.

В народной медицине чабрец применяется, прежде всего, для лечения простудных заболеваний. Он способствует усилению бронхиальной секреции и вследствие этого более быстрой эвакуации мокроты ^{[6, с. 125-127]} и с этой целью его рекомендуют в виде настоя и отвара при бронхите, коклюше, длительном кашле ^{[5, с. 125-127]}.

Отвар травы чабреца обладает болеутоляющим действием и с этой целью используется при невралгиях, радикулитах, плексите, ишиасе, различных болях в животе и кишечнике, головной боли ^{[9, с. 216]}. С этой же целью используется эфирное масло, особенно при невритах, невралгиях, инсульте ^{[4, с. 883]}.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для наших исследований явилось сырье растений рода тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.), состоящего из вегетативных органов этого растения: стебля, листьев, почек и цветов. Сырье заготавливалось в течение 2017-2019 годов в фазу цветения растений в горных районах азербайджана: Кедабекском, Кубинском, Шемахинском, Кахском, Габалинском на лугах, расположенных на высоте 0т 800 до 2200 м. над уровнем моря. Собранное сырье подвергали естественной воздушно-теневой сушке.

Принимая во внимание то, что правильный выбор упаковки и последующее хранение собранного сырья имеет важное значение, мы соблюдали следующие условия хранения собранного материала: помещение для хранения сырья было хорошо вентилируемым, сухим, защищенным от прямого попадания солнечных лучей. При этом собранный материал хранили при комнатной температуре воздуха и защищенным от амбарных вредителей.

Изучение наличия дубильных веществ в составе тимьяна ползучего, было проведено в водно-спиртовых, водных, хлороформных, гексановых извлечениях. Для приготовления изучаемых фракций брали от 0,5 г до 20,0 г заготовленного сырья.

Методика количественного определения дубильных веществ

в траве растений рода тимьян

Исследования проводили в лаборатории биохимии Азербайджанского университета кооперации. В колбу объемом 300 мл. поместили 2,0 гр. измельченного до размера частиц 2 мм сырья тимьяна ползучего и добавили 250,0 мл 40% спирта этилового. Далее взвешиваем на весах с погрешностью ±0,01 г. колбу с содержимым и соединяем с обратным холодильником. Далее колбу поместили на кипящую водяную баню и выдерживали 45 минут, при этом смесь необходимо встряхивать для смывания частиц сырья со стенок колбы. После окончания процесса экстракции колбу необходимо охладить до комнатной температуры, взвесить и довести массу до первоначальной 40% этиловым спиртом. Полученное извлечение необходимо фильтровать для того, чтобы отбросить первые 10,0 мл. фильтрата.

Для центрифугирования в пробирку объемом 50,0 мл. добавили 10,0 мл. полученного извлечения, 10,0 мл. раствора цинка оксида 1% в аммиачном буферном растворе. Смесь, перемешанную стеклянной палочкой, промытой 5,0 мл. дистилированной воды, присоединили к основном смеси. Полученную смесь выдерживали 30 минут, после чего пробирку центрифугировали 7 минут с частотой вращения 5-6 тысяч об/мин. Далее слили жидкость, а к осадку в пробирке добавили 20,0 мл. раствора аммиака 0,25%, взмучили и взвесь присоединили к центрифугируемой смеси. После проведения центрифугирования промывную жидкость отбросили. 20,0-ю мл. спирта этилового 96% промыли осадок в пробирке и растворили его в 3,0 мл. раствора 30% уксусной кислоты. В колбу объемом 300,0 мл. перенесли количественно полученный раствор, прилили 100,0 мл. очищенной воды. Полученную жидкость нейтрализовали при помощи 25,0 мл. раствора натрия гидрокарбоната (5%), долили 0,5 мл. раствора ксиленового оранжевого и провели титрование трилоном Б 0,01 (моль/л) до перехода окраски раствора с красно-фиолетовой до желтой. Следует отметить, что 1,0 мл раствора трилона Б 0,01 (мольл) соответствует 0,0013 гр. танина.

Для определения содержания дубильных веществ в абсолютно сухом сырье в процентах (X) используют формулу:

где:

V – объем раствора трилона Б 0,01, использованного на титрование, в миллилитрах;

K – поправка к титру раствора трилона Б 0,01 (моль/л);

m – навеска сырья, в граммах;

W – потеря массы в процентах при высушивании сырья

При приготовлении реактива осаждения 1,0 гр. цинка оксида взвесили с точностью до 0,01 гр. и поместили в мерную колбу вместимостью 100,0 мл. Далее растворили в смеси 10,0 мл. водного раствора аммиака 25% с 2,5 г. аммония хлорида и объем раствора довели дистилированной водой до метки.

Для приготовления раствора трилона Б 0,01 (моль/л). 3,9 гр. трилона Б, взвешенного с точностью до 0,01 гр, растворили в 300,0 мл. дистилированной воды, профильтровали в мерную колбу вместимостью 1,0 л. и довели объем раствора дистилированной водой до метки. Титр полученного раствора устанавливали по 0,01 (моль/л) раствора цинка.

В вышеизложенном материале мы описали только один стандарт, использованный в исследовании. Но для определения наиболее высокого процента содержания дубильных веществ в собранном материале, мы использовали различные стандарты, а именно: измельченность материала 1,0, 2,0, и 3,0 мм.; состав экстрагента (этилового спирта) 90%, 70%, 50%, 40%, 30%, 20% и дистилированная вода; время выдерживания 60, 45, 30 мин. Следует добавить, что все эксперименты проводились при комнатной температуре окружающей среды, примерно 20-25 градусов по шкале Цельсия.

Результаты и обсуждение

Определение оптимальных условий экстракции дубильных веществ на одном образце тимьяна ползучего, как наиболее распространенного в горных районах азербайджана, проводили двумя методами: перманганатометрическим и комплексонометрическим. При этом мы изучили следующие стадии: экстрагирование общего количества дубильных веществ, очистка полученного комплекса цинк-дубильные вещества.

Количественный анализ дубильных веществ, содержащиеся в видах рода тимьян с использованием вышеуказанных двух методов состоял в следующем: точно взвешенные навески измельченного сырья 2,0 г. помещали в конические колбы объемом на 500,0 мл, доливали 250,0 мл. дистилированной воды и кипятили в течение 30 минут на плитке с обратными холодильниками. Затем извлечения охлаждали, из них 10,0 мл. процеживали в конические колбы объемом на 250,0 мл. Далее по 25,0 мл приготовленных извлечений переносили в конические колбы объемом на 750,0 мл, добавляли 500,0 мл дистилированной воды, раствор индигосульфокислоты в объеме 25,0 мл и проводили титрование раствором калия перманганата (0,02 моль/л) до появления окрашивания золотисто-желтого цвета. В аналогичных условиях проводили контрольный опыт. Количественное определение проводили в пятикратном повторении.

При проведении количественного анализа дубильных веществ наиболее важной и продолжительной стадией является процесс экстрагирования. Процесс экстракции определяется целым рядом факторов, в частности измельченностью сырья, температурой экстракции, временем экстракции, типом растворителя, соотношением сырье-растворитель ^{[6, с. 204]}. В нашем исследовании определение количества дубильных веществ проводили по трем показателям: степени измельченности заготовленного сырья, по влиянию процентного состава экстрагента и по времени экстракции. Для определения влияния измельченности сырья на процент количества выхода дубильных веществ, применяли сырье со степенью измельченности от 1,0 до 3,0 мм. с шагом приращения 0.5. В таблице 1 показана зависимость выхода дубильных веществ от величины измельченности травы тимьяна ползучего.

Таблица 1.

Из таблицы 1 видно, что изучение влияния степени измельченности сырья на количественную экстракцию дубильных веществ показало, что самый высокий процент количества дубильных веществ при комплексонометрическом методе составило 14,38%, при пермангонатометрическом методе – 16,02%. Следовательно, максимальное извлечение дубильных веществ из травы тимьяна ползучего достигается при степени измельчения сырья 2,0 мм.

Литературные данные показывают, что для экстракции дубильных веществ чаще всего в качестве экстрагента применяется кипящая дистилированная вода и водно - спиртовые растворы ^{[2, с. 16-18]}. В нашем исследовании для определения общего количества дубильных веществ в тимьяне ползучем были проведены опыты с применением раствора этилового спирта 90%, 70%, 50%, 40%, 30%, 20% и очищенная вода. В таблице 2 приведены результаты влияния экстрагента различной концентрации на полноту экстракции дубильных веществ из травы тимьяна ползучего.

Таблица 2.

Из таблицы 2 видно, что самый высокий процент содержания дубильных веществ при применении комплексонометрического метода составил 12,69%, а при пермангонатометрическом методе – 14,81%. Следовательно, лучшим экстрагентом для экстракции дубильных веществ из тимьяна ползучего может служить спирт этиловый 40%. Для экстракции дубильных веществ, применяли экстрагирование на кипящей водяной бане до наступления равновесия; при этом экстракцию вели на кипящей водяной бане.

Влияние времени экстрагирования на полноту извлечения дубильных веществ из травы тимьяна ползучего приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Из таблицы 3 видно, что максимальный выход дубильных веществ наблюдался через 45 минут при соотношении сырье-растворитель 2:250.

По результатам вышеизложенных исследований и принимая во внимание процентное содержание общего количества дубильных веществ в тимьяне ползучем, приведенных в трех таблицах, можно сделать вывод, что наибольшее значение было определено пермангонатометрическим методом, а комплексонометрический метод, по сравнению с пермангонатометрическим дает результаты почти в 2 раза ниже. Указанное расхождение результатов анализа двумя методами можно объяснять различной избирательностью этих методов к дубильным веществам в смеси с сопутствующими веществами. Для того, чтобы показать, что комплексонометрический метод является более объективным в определении дубильных веществ по отношению к пермангонатометрическому, нами было проведено титрование раствором калия перманганата фильтров травы тимьяна ползучего, полученных после осаждения и отделения дубильных веществ реактивом осаждения.

В результате титрования в фильтрате найдено 3,52 % веществ, не осаждаемых реактивом осаждения. Далее, было интересным исследовать состав центрифугатов после осаждения дубильных веществ в методе комплексонометрии. Получение центрифугаты нейтрализовали кислотой серной до слабокислой реакции и экстрагировали их этилацетатом. Полученные этилацетатные извлечения и исходные извлечения хроматографировали на бумаге и тонких слоях сорбента в различных системах растворителей. Хроматографический анализ подтвердил, что фенольные соединения (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины) остаются в центрифугах и данный метод позволяет определить дубильные вещества в присутствии других фенольных соединений ^{[1, с. 174-179]}.

Выводы

По результатам исследования установили, что определение оптимальных условий для вычисления содержания общего количества дубильных веществ в тимьяне ползучем, заготовленным в горных районах Азербайджана, выполненным двумя методами (перманганатометрическим и комплексонометрическим) самый высокий процент количества дубильных веществ образуется при измельченности сырья размером 2,0 мм., при применении в качестве экстрагента 40% этилового спирта и времени экстракции 45 минут. Таким образом, результаты проведенных нами исследований способствовали разработке методики оптимального количественного определения дубильных веществ в траве тимьяна ползучего, произрастающего в нашей республике.